【翻译】二甲双胍联合PD-1/PD-L1药物激活NSCLC患者外周血免疫细胞的抗肿瘤免疫反应

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41419-025-07636-7
以下翻译由AI提供

摘要

免疫疗法已经改变了非小细胞肺癌 (NSCLC) 的治疗前景，但实现持久的益处仍然是一个挑战。对免疫疗法的抗性机制是复杂的，涉及尚未完全理解的肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用。二甲双胍是一种FDA批准的糖尿病药物，它有望通过增强抗肿瘤免疫反应来增强免疫疗法的功效，尽管其潜在的分子途径仍在研究中。本研究利用癌症和免疫细胞的共培养模型，探讨二甲双胍联合anti-PD-1/PD-L1疗法对LKB1突变体 (LKB1mut) 抗肿瘤免疫反应的影响。与野生型 (LKB1wt) NSCLC细胞相比，以及来自NSCLC患者的外周血免疫细胞。通过批量RNA测序表征LKB1mut和LKB1wt NSCLC细胞的转录组谱，以了解二甲双胍诱导的基因表达变化。晚期NSCLC患者提供外周血单核细胞 (pbmc) 用于分析。该研究评估了二甲双胍单独和与anti-PD-1/PD-L1剂组合对先天免疫途径的影响。结果表明，二甲双胍激活pbmc中的cGAS-STING途径和干扰素，增强其抗肿瘤能力。值得注意的是，用二甲双胍和免疫疗法处理的免疫细胞表现出协同作用，显著减少lkb1mutnsclc细胞中的集落形成。此外，来自NSCLC患者的单核细胞在共培养中显示出NSCLC细胞的活力降低，与LKB1状态无关，并且在联合治疗下向抗肿瘤M1表型转变。这些发现得到了涉及肿瘤球体和患者来源的类器官的3D共培养模型的支持，强调使用二甲双胍和免疫治疗剂来增强来自NSCLC患者的各种免疫细胞亚群的抗肿瘤活性的新的生物学原理。

导言

肺癌是全球最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡率的主要原因 [1]。非小细胞肺癌 (NSCLC) 占大多数病例 (85%)，包括肺腺癌 (LUAD)，肺鳞状细胞癌 (LUSC)，和大细胞癌 (LCC) [2]。尽管抗PD-1/PD-L1药物的出现彻底改变了晚期NSCLC患者的管理，但并非所有患者都能获得持久的益处 [3]，而抵抗的机制在很大程度上仍然未知。

在LUAD中，丝氨酸/苏氨酸激酶11 (STK11)，也称为肝激酶B1 (LKB1)，是继TP53和KRAS之后第三个最常见的突变基因。在高达33% 的原发性LUAD病例中发现突变 [4]。携带STK11突变的肿瘤表现出 “免疫冷” 表型，其特征在于低或不存在PD-L1水平和无效的T细胞浸润。此外，STK11/LKB1失活是对anti-PD-1药物原发性耐药的主要遗传驱动因素，STK11和KEAP1基因的共突变与anti-CTLA4和anti-PD-1药物双重免疫治疗的敏感性高于anti-PD1独自一人 [5,6]。在这种情况下，我们的小组先前证明了干扰素基因 (STING) 激活的刺激物可识别具有免疫反应性表型的NSCLC患者 [7]。从机制上讲，STK11突变导致LKB1丢失，从而导致 (STING) 的抑制。因此，已提出在STK11突变体LUAD中重新激活STING作为支持抗肿瘤免疫反应的有前途的方法 [8]。最近，我们还确定了来自肺癌患者，特别是NSCLC患者的外周血单核细胞 (pbmc) 中的cGAS-STING激活可以作为对免疫疗法反应的新型预测性生物标志物 [9]。

一些证据表明，抗糖尿病药物二甲双胍 (MET) 在各种癌症类型中发挥抗癌作用，包括肺癌，前列腺癌和结肠癌 [10]。临床前数据支持MET作为辅助药物在肺癌治疗中的作用，无论是与化疗还是与靶向药物和免疫疗法结合 [11]。特别是，MET可以调节免疫微环境的不同成分，并促进促免疫功能 [12]; 但是，尚不清楚MET是否可以增强免疫疗法的功效，特别是在STK11突变型NSCLC中。

我们的I/II期剂量递增研究评估了二甲双胍治疗在非糖尿病癌症患者人群中的可行性，特别是证实了二甲双胍和厄洛替尼作为具有野生型EGFR的IV期NSCLC的二线治疗 [13,14]，使其成为新型组合的理想伴侣药物。

在这项研究中，我们假设MET治疗可能会影响抗肿瘤免疫反应的激活，包括STING激活和相关途径，并直接影响免疫细胞。在这里，我们试图评估MET与免疫治疗剂组合在LKB1-mutant NSCLC肿瘤和各种pbmc亚群中的功效，特别是从未经治疗的NSCLC患者分离的淋巴细胞和单核细胞。最后，我们在二维和三维共培养模型中利用肿瘤球体和患者来源的肿瘤类器官 (PDTOs) 验证了体外和离体发现阐明二甲双胍和anti-PD-1/PD-L1免疫疗法对癌症和免疫细胞之间相互作用的影响。

材料和方法试剂

二甲双胍、阿特珠单抗和派姆单抗购自Selleck化学公司 (德克萨斯州休斯顿)。

细胞系

将NSCLC细胞系NCI-H1299 (atcccat # CRL-5803) 和NCI-H460 (atcccat # HTB-177) 维持在补充有10% FBS (sigma-aldrich) 的RPMI-1640 (sigma-aldrich) 中。1X青霉素-链霉素 (sigma-aldrich) 和1X两性霉素b (sigma-aldrich) 在湿度控制的环境中 (37 °C，5% CO2)。细胞系获自美国典型培养物保藏中心 (ATCC)。监测细胞系形态，并使用支原体检测试剂盒 (InvivoGen) 常规测试细胞系的支原体。

RNA测序

用2mm二甲双胍和10 μ g/ml阿特珠单抗处理细胞系和pbmc 48小时。收获细胞并使用rneasyplus迷你试剂盒 (QIAGEN) 纯化RNA。样品由Novogene有限公司分析。详细的rna-seq程序在补充材料文件中描述。

MTT测定

如前所述进行MTT测定 [15]。简言之，将细胞以5000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并与pbmc (比例1:10) 共培养。处理48小时后，加入甲基噻唑基二苯基-溴化四唑鎓 (MTT，Sigma化学公司)。4 °c后，通过加入DMSO裂解细胞。通过分光光度法测定490nm处的吸光度来确定活细胞的数量。

蛋白质印迹分析

通过在RIPA缓冲液 [0.1% SDS，0.5% 脱氧胆酸盐，1% Nonidet，100 μ mmol/L NaCl，10 μ mmol/L tris-hcl (pH 7.4)，0.5  mmol/L DTT，0.5% PMSF，蛋白酶抑制剂混合物 (hoffmann-la Roche) 和PhosSTOP (Roche Diagnostics)] 并通过在4 °C下以12.450 °rpm离心20 °C澄清。通过改良的Bradford测定法 (bio-rad) 估算蛋白质量，通过sds-page解析并电转移到硝酸纤维素膜 (bio-rad) 上。在室温下封闭膜90 °C后，将它们与第一抗体在4 °C下孵育过夜，然后与第二抗体在室温下孵育1 °C。使用ChemiDoc (bio-rad) 用Clarity Western ECL底物检测蛋白质。使用图像实验室3.0.1分析图像。针对LAMIN A/C (2032，1:1000)，CASPASE-8 (1C12) (9746，1:1000) 和 β-肌动蛋白 (8H10D10，1:2000) 购自Cell Signaling。

患者队列和PBMCs分离

入选在接受任何治疗之前在基线处诊断为NSCLC的患者。患者的特征列于表1。组织活检中PD-L1肿瘤表达水平的代表性IHC图像在补充图中报告。S1。根据赫尔辛基宣言 (坎帕尼亚大学 “Luigi Vanvitelli” 和那不勒斯No. 280，2020年5月16日)。如前所述，将NSCLC患者的血液收集在BD vacutainer喷涂的K2EDTA管中 [9]。简言之，通过Lymphosep (Aurogene) 分离pbmc。用PBS洗涤pbmc，并在补充有10% FBS和ix青霉素-链霉素 (sigma-aldrich) 的RPMI-1640培养基 (sigma-aldrich) 中培养。24小时后，通过粘附机械分离单核细胞，并通过悬浮分离淋巴细胞。

表1.患者的基线临床特征。

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免疫组织化学 (IHC)

使用Ventana平台 (Ventana BenchMark ULTRA系统) 对福尔马林固定，石蜡包埋 (FFPE) 的组织样品的4微米切片进行免疫组织化学 (IHC)。根据制造商的说明。使用以下抗体: anti-PD-L1 (兔单克隆第一抗体，克隆SP263，VENTANA)。根据在任何强度下表现出膜染色的肿瘤细胞 (tc) 的百分比来解释IHC染色，并根据IMpower010研究数据对其进行评分 [16]:

• 阴性染色: TCs <1% 表达PD-L1；
• 阳性染色: PD-L1在 ≥ 1% 的TCs上表达；
  
  

根据阳性TCs的百分比对PD-L1阳性病例进行分层:

• PD-L1表达范围从1% 到49% 的TCs；
• 在 ≥ 50% 的TCs上PD-L1表达。
  
  

集落形成试验

将1000个细胞/孔接种在6孔板上。第二天用2mm二甲双胍、10 μ g/ml阿特珠单抗和10 μ g/ml派姆单抗处理板。10天后，用4% PFA固定菌落，并用在10% 甲醇中的1% 结晶紫染色。

RNA提取、cDNA合成和qrt-pcr

根据制造商的方案，使用TRIzol (Invitrogen) 获得总RNA。简言之，用TRIzol裂解细胞。加入氯仿，然后将样品在4 °C下以12，000xg离心15 °C。将水相转移到另一个管中。通过在-80 °C下与异丙醇混合2 °C沉淀RNA。将样品在4 °C下以12，000xg离心10分钟，并用75% 乙醇洗涤。将总RNA悬浮于不含RNA酶的水、0.1 °mmedta溶液中，并在57.5 °C的加热块中孵育10 °C。使用Nanodrop 2000分光光度计 (thermofisherscientific) 通过od260/280读数测定RNA的纯度和浓度。使用sensifastcdna合成试剂盒 (meridianbioscience) 产生cDNA。使用sensefast SYBR hi-rox试剂盒 (meridianbioscience)，用quantstudi7-Flex (应用生物系统) 通过qrt-pcr评价mRNA表达水平。通过标准化至18s来确定相对基因表达，并通过2-ΔΔCt方法计算。用于qrt-pcr的引物序列列表见补充表1。

球体形成和免疫荧光染色

通过接种8 × 10产生肿瘤球体4如前所述，细胞处于超低附着状态 (康宁) [9]。通过添加5 × 10开始共培养5SCLC患者每孔衍生免疫细胞。在共培养之前，将2.5 μ m CellTracker深红色染料 (Invitrogen) 添加到PBMC培养基中45分钟，并添加5 μ m CellTracker Blue CMAC (Invitrogen) 添加到球状体培养基中45分钟。染色后，将pbmc添加至球状体 (比例1:10) 并进行共培养48小时。使用celldiscoverer7显微镜 (zeissolympus，Nikon) 对荧光成像。用ImageJ软件进行荧光强度的定量。

患者来源的肿瘤类器官生成

如前所述，从NSCLC患者获得的肿瘤组织用于生成肿瘤类器官 [17]。通过将其切成2-4mm的小片来处理活检，并用补充有1% 青霉素-链霉素的PBS洗涤。将切碎的组织与消化培养基 (5 ° mg/ml II型胶原酶，100 ° μ g/ml DNase I，10 ° μ g/ml Y-27632二盐酸盐在高级DMEM/F-12中孵育，1X青霉素-链霉素和1X两性霉素b) 在37 °C下在摇动平台上保持1 °C。将消化的组织在200 °c下离心。 g在室温下5分钟，用AdDMEM/F-12洗涤，并在37 ℃ 下在振荡平台上与胰蛋白酶 + 二盐酸Y-27632 (10 μ m) 一起温育。然后，加入补充有1X青霉素-链霉素、1X两性霉素b和20% FBS的冷adDMEM/F12   ++，以停止消化。将所得细胞在类器官培养基的Matrigel液滴中培养 (类器官培养基的组成列于补充材料中)。

流式细胞术分析

通过流式细胞术分析的肿瘤细胞分离试剂盒 (miltenyibiotec) 分离肿瘤浸润淋巴细胞。TILs染色: 活死蓝 (Invitrogen)，使用的抗体是抗人CD3 (UCHT1，SK7) 、CD4 (L3T4，SK3) 、CD8 (SK1) 、CD56 (NCAM16.2)。

统计分析

结果表示为平均值   ±  SEM或SD。使用非配对t检验进行两组分析。使用单向ANOVA检验分析具有一个独立变量的三个或更多个组。使用双向ANOVA检验分析具有两个独立变量的三个或更多个组。皮尔逊相关系数和相应的p-使用prism8 (GraphPad软件) 计算值。

结果LKB1mut和LKB1wt NSCLC细胞的转录组学特征

我们分析了LKB1-mutant NSCLC细胞 (H460) 与LKB1-wild 1型 (H1299) 相比的转录组特征。如图所示。1A我们发现4752个上调基因和6234个下调基因 (倍数变化 (FC) >  1.30；p与LKB1wt相比，LKBmut细胞中的值  <  0.05)。鉴于LKB1丢失在AMPK激活下调中的关键作用，我们分析了AMPK信号通路 (hsa04152) (图。1B)。Rna-seq数据证实了LKB1mut细胞中AMPK基因转录 (PRKAG1) 的下调及其信号传导途径的上调以及mTOR mRNA的上调。然后，我们想知道LKB1损失是否与所选细胞中免疫应答的调节一起发生。有趣的是，Toll样受体信号通路 (map04620) (图。1C) 和胞质DNA感应途径 (map04623) (图。1D) 显示出与免疫反应有关的关键基因转录的强烈减少，例如IFNs，IRFs，TBK1和cGAS-STING。

图1: LKB1mut对lkb1wtnsclc细胞系的RNA测序。

                               
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A跨LKB1mut与LKB1wt比较的DEGs。折叠变化 (FC) >  1.30和p值  <  0.05。B-DKEGG通路富集分析的结果。红色和绿色条分别代表基于其rna-seq表达的所选途径的差异表达的上调基因和下调基因。数据以Log2FC值表示，所有列出的基因p值 <0.05。

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二甲双胍对LKB1mut和LKB1wt NSCLC细胞cGAS-STING下游通路激活的影响

在用MET处理后，我们对LKB1mut和LKB1wt细胞系进行了RNAseq和DEGs。如图所示。2A,与未处理的细胞相比，MET处理的LKB1mut细胞中AMPK基因表达和AMPK信号通路 (hsa04152) 显著上调。有趣的是，在LKB1mut细胞中使用MET治疗诱导了与胞质DNA感应途径 (map04623) 相关的ifn β，CCL5，CXCL10和IRF3的显着增加 (图。2B)。相反，MET处理对AMPK信号通路和胞质DNA传感通路的影响不同 (图。2C-D) 在LKB1wt细胞中，因此表明MET激活LKB1mut NSCLC细胞中的AMPK和胞质DNA传感途径。

图2: 用二甲双胍处理对lkb1mutnsclc细胞系中cGAS-STING下游活化的影响。

                               
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A, B与CTR相比，用MET处理的LKB1mut细胞中KEGG途径富集分析的结果。数据以Log2FC值表示，所有列出的基因p值 <0.05。C、D与CTR相比，用MET处理的LKB1wt细胞中KEGG途径富集分析的结果。红色和绿色条分别代表基于其rna-seq表达的所选途径的差异表达的上调基因和下调基因。数据以Log2FC值表示; 所有列出的基因p值 <0.05。E代表性的免疫荧光图像，p-IRF3平均荧光强度 (MFI) 和核定位 (绿色/蓝色合并) 显示p-IRF3 (绿色)，MitoTracker (红色) 和DAPI (蓝色) 在用2 °mm的MET处理的H460细胞中 (比例尺: 10 μ m，放大倍数63X)。每个实验在三个技术重复中进行。数据表示为平均值   ±  SD. ****p <  0.0001; *p <  0.05。

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为了进一步证实在LKB1突变的NSCLC细胞中由二甲双胍处理诱导的DNA传感通路的激活，我们进行了IF染色以评估激活的p-IRF3向细胞核的亚细胞易位，它促进IFN基因的转录。如图所示。2E,与CTR相比，我们在H460细胞中观察到二甲双胍治疗后p-IRF3向核区室的显着易位。相反，如补充图所示，在H1299细胞中没有检测到显著的p-IRF3易位。S2。总之，我们的结果证实二甲双胍在LKB1突变的NSCLC细胞中更大程度地诱导cGAS-STING活化。

二甲双胍对初免非小细胞肺癌患者免疫细胞的影响

鉴于MET治疗对不同实体瘤中免疫细胞的广泛抗肿瘤作用，特别是增加肿瘤浸润淋巴细胞水平和上调T细胞炎症表达谱12,我们表征了MET对来自幼稚NSCLC患者的免疫细胞的作用是rna-seq和DEGs (图。3A)。特别地，如图所示。3B,与CTR相比，我们在用MET处理的pbmc中发现了5181个上调基因和4266个下调基因。自上而下调节的基因 (P <  0.05) 是VCAN (Log2FC   =  − 6，54391)，VEGFA (Log2FC   =  − 4，11021)，CXCL12 (Log2FC   =  − 2，36826)，CCL5 (Log2FC   =  − 1，152) 和CCL20 (Log2FC   =  − 0，59993) (图。3C)。VCAN和VEGF在调节细胞运动，生长和分化中起作用。CXCL12和CCL5充当对T淋巴细胞和单核细胞有活性的化学引诱物。CCL20负责效应/记忆T细胞和b细胞的趋化性 [18]。与CTR相比，在MET处理的pbmc中最显著的上调基因中，我们发现CXCL5 (Log2FC   =   3，284284)，CCL18 (Log2FC   =   2，510331)，CXCL10 (Log2FC   =   2，063503) 和STING基因TMEM173 (Log2FC   =   1，333424)。CXCL5和CCL18主要参与中性粒细胞和淋巴细胞的趋化活性 [19]。已知CXCL10发挥多效性作用，包括刺激单核细胞，自然杀伤和T细胞迁移以及调节粘附分子表达 [20]。它也是对病毒感染的免疫反应的关键调节剂 [21] 和一个参与免疫反应的关键cGAS下游趋化因子 [9]。最后，通过STING基因上调转录的先天免疫激活 (TMEM173) 表明用MET处理的pbmc增加了先天免疫应答的特征。

图3: 在NSCLC患者来源的pbmc中使用二甲双胍治疗的效果。

                               
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AMET治疗的NSCLC患者来源的PBMC与CTR中的DEGs。B与CTR相比，用MET处理的pbmc中DEGs分析的火山图。数据显示为Log2FC值，绿色和红色列出的基因p值 <0.05。CNSCLC患者来源的pbmc与CTR中最显著的DEGs。红色和绿色条分别代表基于其rna-seq表达的所选途径的差异表达的上调基因和下调基因。数据显示为Log2FC值，绿色和红色列出的基因p值 <0.05。DDEG的点图显示与MET处理的pbmc相对于CTR相关的最高显著富集生物过程 (BP)。基因比率被定义为交集大小和查询大小之间的比率。点大小表示富集丰度，而颜色表示调整后的p值 (padj) (蓝色到红色)。E与CTR相比，用MET处理的pbmc中KEGG途径富集分析的结果。红色和绿色条分别代表基于其rna-seq表达的所选途径的差异表达的上调基因和下调基因。数据以Log2FC值表示，所有列出的基因p值 <0.05。F实时PCR分析患者来源的pbmc中的体外STING、c-gas、IFI16、IL1β 、CXCL10和CCL5 mRNA表达。将mRNA水平的变化标准化为管家基因的表达 (18s)。数据表示为平均值   ±  SEM，来源于n =   2按比较法2  −  ∆ ∆ ct技术计算。Ci   =   95% 的单尾不成对学生t检验。统计意义: **p <  0.01; *p <  0.05。

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然后，与未处理的CTR相比，我们对用MET处理的NSCLC患者分离的pbmc进行基因本体论 (GO) 富集分析。图3D显示与CTR相比，MET治疗在来自NSCLC患者的pbmc中诱导与跨膜转运蛋白和离子通道活性以及趋化因子介导的信号传导途径和体液免疫应答相关的基因集的正调节。离子的跨膜转运是维持免疫细胞亚细胞器完整性和稳态的基本特征 [22] 并有利于炎性细胞因子的释放 [23]。

因此，我们根据AMPK分析了来自rna-seq数据的DEGs结果，与未治疗的CTR相比，MET治疗后NSCLC患者来源的pbmc中的Toll样受体信号传导和胞质DNA传感通路富集 (图。3E)。在AMPK信号通路 (hsa04152) 中，我们发现内质网 (ER) 蛋白CAMP反应元件结合蛋白3样1 (CREB2L1) 是与tgf-β 激活的激酶MAP3K7CL一起上调最多的基因，因此表明pbmc中免疫激活的增加。关于Toll样受体信号通路 (map04620)，最丰富的基因转录是nf-κb激活蛋白502 (TICAM2)，已知其在促进导致I型干扰素诱导的下游信号传导中的作用，以及IFNA、IL1B和cxcl8的富集。最后，分析了胞质DNA感应途径 (map04623) 显示上调最多的基因是cGAS以及RIPK4基因的富集，该基因以其在nf-κb激活中的作用而闻名。我们通过分析从NSCLC患者分离的pbmc中胞质DNA传感途径和Toll样受体信号通路的表达，通过rt-qpcr进一步证实了这些发现 (图。3F)。有趣的是，我们发现cGAS的显着增加 (p <  0.01), IL-1β (p <  0.01) 和CCL5 (p 与未治疗的CTR相比，在用MET治疗后的NSCLC患者来源的pbmc中， <  0.05)。总体而言，这些数据表明由MET治疗对NSCLC患者的pbmc诱导的阳性前免疫效应。

二甲双胍和anti-PD-L1联合应用对淋巴细胞抗NSCLC细胞活性的影响

然后，我们基于NSCLC细胞的LKB1状态，研究了MET治疗与anti-PD-L1药物组合在诱导免疫细胞中对NSCLC细胞的功能性抗肿瘤免疫应答中的作用。正如我们在以前的研究中所报道的那样 [24]，H460和H1299细胞系显示85% 的PD-L1百分比。在无花果中。4A,我们评估了与单独用MET或与anti-PD-L1组合预处理的NSCLC患者来源的pbmc共培养的LKB1mut和LKB1wt NSCLC细胞的活力。有趣的是，我们发现与LKB1wt细胞相比，LKB1mut NSCLC细胞系H460在与单独用MET处理并与anti-PD-L1组合的pbmc共培养时显示出更高的细胞活力降低 (图。4A)。与免疫细胞共培养后，我们从细胞周期和凋亡标志物表达方面分析了NSCLC细胞H1299和H460的蛋白表达，以进一步研究MET激活的免疫细胞诱导细胞死亡的机制。我们发现单独用MET处理的pbmc不能诱导NSCLC细胞系的体外细胞死亡，而MET与anti-PD-1/PD-L1的组合通过Caspase-8增加H1299和强Lamin A/C上调来激活免疫细胞介导的细胞毒性 (图。4B)。

图4: 二甲双胍和anti-PD-L1组合对淋巴细胞对NSCLC细胞的抗肿瘤活性的影响。

                               
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A暴露于用二甲双胍 (MET) 预处理并anti-PD-L1 48小时的NSCLC患者来源的pbmc的LKB1wt (H1299) 和LKB1mut (H460) NSCLC细胞的细胞活力测定。数据表示为平均值   ±  SD。进行至少三次独立实验。B在与NSCLC患者来源的pbmc共培养48小时后，H460和h1299nsclc细胞系的蛋白质印迹使用 β-肌动蛋白来确保相等的加载。C将H460和h1299nsclc细胞系接种在12孔板 (3000个细胞/孔) 中。将细胞与用药物预处理5天的NSCLC患者来源的pbmc一起预孵育48小时。之后，将细胞固定并用0.5% 结晶紫溶液染色。扫描并显示代表性孔的图像。H1299nsclc细胞的集落数的条形图以蓝色显示，而h460nsclc细胞以红色显示。结果表示为三次技术重复的平均值 ± SD。D实时PCR分析体外STING，c-gas，CXCL10和CCL5 mRNA在患者来源的单核细胞中的表达 (n =   11)。将mRNA水平的变化标准化为管家基因的表达 (18s)。数据表示为平均值   ±  SEM，来源于n =   2按比较法2  −  ∆ ∆ ct技术计算。Ci   =   95% 的单尾不成对学生t检验。E用MET和/或anti-PD-L1 48 °h条件培养基处理的NSCLC患者分离的单核细胞培养的NSCLC细胞系的细胞活力测定。每个实验一式三份进行。数据表示为平均值   ±  SD. ****p <  0.0001; ***p <  0.001; **p <  0.01; *p <  0.05。

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我们还研究了MET与免疫治疗剂组合对诱导免疫细胞中抗肿瘤活性的影响。如图所示。4C-D与对照组相比，在用pbmc培养的H460细胞中观察到集落数量的适度减少。单独使用MET或与anti-PD-L1组合使用MET的治疗显着降低了集落形成能力以及免疫细胞对这些LKB1-mutant细胞的反应。这一发现表明，MET和免疫疗法的组合可以影响LKB1-mutant肿瘤激活免疫细胞以表现出抗肿瘤活性的集落形成能力。此外，anti-PD-1/PD-L1不影响集落形成，强化了LKB1-mutant细胞对免疫疗法表现出内在抗性的观点。有趣的是，与对照相比，与H1299细胞共培养的pbmc显著影响集落形成。MET、anti-PD-L1、anti-PD-1及其组合的应用导致H1299细胞内集落数的显著减少。这些结果表明，将MET添加到免疫治疗方案中有效地促进了针对LKB1-mutant和LKB1-wild型细胞的免疫介导的抗肿瘤应答。总的来说，共培养结果表明，MET能够激活抗肿瘤免疫细胞功能，导致体外细胞毒性，细胞凋亡和降低长期肿瘤存活率，独立于LKB1突变状态。这意味着对免疫疗法表现出不良反应的患者可能会受益于将MET纳入其治疗方案。

单核细胞在介导免疫反应的抗肿瘤功能中起着核心作用 [25]，因此我们分析了MET对PBMC分离的单核细胞的影响。来自幼稚NSCLC的pbmc (n 收集   =   11)，随后通过粘附在培养物中分离单核细胞。在用MET和/或anti-PD-L1处理48小时后，我们分析了cGAS-STING先天免疫途径的mRNA表达。有趣的是，在NSCLC患者来源的单核细胞中，单独使用MET或与anti-PD-L1联合使用MET治疗后，STING和cGAS均显着上调 (p <  0.0001)。然后，我们通过rt-pcr表征了抗肿瘤M1和亲肿瘤M2表型不同的亚群 (图。4D) [26]。如图所示。4D我们发现，与对照相比，MET和atezolizumab的组合治疗显着增加了M1标记IL-1β 和tnf-α，并且与M2标记调节相比具有更高的倍数增加。

最后，在图。4E,我们评估了预处理的单核细胞通过与NSCLC细胞共培养介导体外抗肿瘤作用的能力。值得注意的是，来自MET处理的单核细胞的条件培养基显著降低了LKB1-wild型细胞中的细胞活力。相反，无论LKB1突变状态如何，MET与免疫治疗剂的组合均显示出对两种细胞系的功效。这进一步证实了将MET与免疫疗法结合使用的益处。

二甲双胍和anti-PD-L1联合使用对免疫细胞对NSCLC肿瘤球体和患者来源的3D肿瘤类器官的抗肿瘤活性的影响

我们利用源自LKB1-mutant细胞的3D NSCLC冷肿瘤球体，在功能上验证了我们关于MET对源自NSCLC患者的pbmc的促免疫作用的体外发现。在肿瘤球体形成后，我们建立了包含肿瘤球体和源自NSCLC患者的免疫细胞的3D培养物，我们监测了LKB1-mutant NSCLC H460细胞产生的球体三维结构随时间的发展 (图。5A)。共培养48小时后，我们评估了免疫细胞 (红色) 渗入3D肿瘤 (蓝色) 的能力 (图。5B)。我们的结果表明，单独或与anti-PD-1或anti-PD-L1药物联合使用MET治疗，显著增强了免疫细胞在肿瘤球体内的共定位 (图。5C)。同时，肿瘤球体的生存能力明显降低 (图。5D)。该模型提供了用于预测MET对LKB1-mutant肿瘤诱导的促免疫作用的功能性体外框架。此外，这些发现表明MET具有将冷肿瘤转化为发炎肿瘤的潜力。

图5: 二甲双胍和anti-PD-L1组合对免疫细胞对NSCLC lkb1mut3d肿瘤球体的抗肿瘤活性的影响。

                               
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A在铺板后6天铺板于培养物中并用MET和anti-PD-L1或anti-PD-1处理的lkb1muth460球状体的明场图像。比例尺，100  mm。B代表性IF图像显示免疫细胞在H460细胞的3D肿瘤球体中的浸润能力。3D肿瘤球体被蓝色染色，并且源自NSCLC患者的pbmc被红色染色。将pbmc用MET和anti-PD-L1或anti-PD-1处理48小时，并添加至3D球状体以开始共培养。NSCLC细胞和pbmc的共定位在合并列下报告。比例尺100 ° µ m。C评估红/蓝强度比作为LC细胞和PBMC共定位率的定量指标。****p <  0.0001。D与MET、anti-PD-L1或anti-PD-1预处理的NSCLC患者来源的pbmc共培养48小时的PDTOs的细胞活力测定。数据表示为三个独立实验的平均值   ±  SD。****p <  0.0001。

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最后，我们验证了我们在从NSCLC活检建立的离体3D肿瘤中MET对NSCLC患者来源的pbmc的促免疫作用的体外发现。来自用于3D肿瘤建立的NSCLC患者的肿瘤组织活检的PD-L1表达水平在图1中报告。S2B。组织活检消化后，我们通过磁珠结合分离了肿瘤浸润淋巴细胞 (til) (图。6A)。然后我们进行流式细胞术分析以表征和定量til的 %。如图所示。5A分离后，90.6% 的活til，其中4.2% 为CD3 + 细胞，0.4% 为CD56 + 细胞。在CD3 + 门控细胞中，大多数细胞是细胞毒性T淋巴细胞 (CD8   +  )。在无花果中。6B我们总结了从NSCLC患者活检中分离的til的主要亚群。此后，我们建立了活检分离的肿瘤和免疫细胞的3D培养物，并监测了三维结构随时间的形成 (图。6C)。一旦建立了类器官培养物，在几次传代后，免疫细胞可以被耗尽，因此我们用用与anti-PD1/PD-L1药物组合的MET预处理的自体pbmc冲洗pdto。共培养48小时后，我们测试了肿瘤类器官和球状体的细胞活力。如图所示。6D,MET单独或与anti-PD-L1联合使用能够诱导PDTOs的细胞活力显着降低，最终证实了二甲双胍和anti-PD-1/PD-L1剂联合使用的翻译潜力。

图6: 二甲双胍和anti-PD-L1组合对免疫细胞对NSCLC患者来源的肿瘤类器官的抗肿瘤活性的影响。

                               
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A肿瘤浸润性分离方法的图形总结。图形方案是由作者使用免费的BioRender平台制作的。B用于分析NSCLC肿瘤组织中活淋巴细胞亚群的流式细胞术图。首先将细胞门控成CD3 + 或CD56   +  ，然后是CD4   +  T细胞 (CD3   +   CD56  -   CD4   +   CD8  -  ) 和CD8   +  T细胞 (CD3   +.CD56  -.CD4  -   CD8   +  ) 被鉴定。与轮廓区域相邻的数字表示每个样品中细胞的百分比。C平板接种后6天，NSCLC患者来源的癌症类器官接种在椎间盘培养物中的明视野图像。比例尺，100  mm。D用MET单独或与anti-PD-1或anti-PD-L1组合处理48小时的nsclcpdtos的细胞活力测定。数据表示为三个独立实验的平均值   ±  SD。****p <  0.0001。

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讨论

近年来，免疫疗法已成为晚期NSCLC患者的主要治疗选择之一，这极大地受益于这种方法。然而，根据目前的选择标准，并非所有患者都能对免疫检查点抑制剂产生持久反应 [27]。在这种情况下，对免疫疗法的原发性或继发性抗性的发展突出了对调节抗肿瘤免疫功能的替代MET的需求。最近，已经证明MET与PD-1抑制剂联合通过抑制STING泛素化增强STK11突变型NSCLC的抗肿瘤功效 [28]，表明MET在对免疫疗法反应不佳的患者中具有积极的促免疫作用。先前的临床试验表明，在接受免疫治疗的NSCLC患者中添加MET的临床益处 [29,30]，但样本量小和缺乏对LKB1突变的评估可能限制了他们的结论。

我们的研究采用了多种体外和离体模型，包括NSCLC细胞，患者来源的免疫细胞，2D和3D肿瘤球状体共培养物以及PDTOs。我们证明了MET与anti-PD-1/PD-L1的组合通过激活关键的胞质DNA传感器和增强促免疫特性有效地刺激抗肿瘤免疫应答，特别是在LKB1突变型NSCLC肿瘤中。这些结果为MET的促免疫作用提供了新的见解，表明它有可能在免疫治疗效果不佳的患者中重新激活免疫反应。我们认为，MET处理的免疫细胞可能会增加趋化因子的分泌，帮助额外的免疫细胞募集到肿瘤微环境，并克服LKB1mut肿瘤中存在的免疫抑制屏障。

然而，必须注意几个限制。细胞和类器官模型的结果可能无法完全捕捉体内肿瘤微环境的复杂性。此外，由于内在的异质性，患者对免疫疗法的反应可能会显着变化，从而使有关MET组合在更广泛人群中的有效性的预测复杂化。纵向研究对于评估短期疗效和免疫反应的持久性至关重要。这些考虑强调需要进一步的研究来验证我们的发现并改进NSCLC的治疗策略。

总之，我们的研究表明，MET与anti-PD-1/PD-L1疗法的组合可能是一种有希望的治疗策略，以增强诊断为NSCLC的患者的先天免疫反应，特别是对于那些携带LKB1突变的人，这些突变往往通过利用与MET相关的独特作用机制而免疫反应较差，它似乎调节关键信号通路并促进促免疫功能，我们提供了令人信服的证据，证明其在NSCLC患者亚群中重新激活免疫反应的潜在作用。

数据可用性

与所呈现的结果相关的大多数数据都包含在本文的材料和方法部分中。Rna-seq原始数据由Novogene，inc.生成，并可根据要求从相应作者处获得。