目前没有针对STK11-deficient NSCLC的分层医学选择。STK11缺失介导mTORC激活、GLUT1上调和糖酵解增加。这种代谢重编程可能代表mTORC1/2抑制可靶向的治疗脆弱性。在国家肺基质试验的B2组中，54例NSCLC患者接受了vistusertib治疗，其中49例STK11-deficient (30例KRAS突变 (B2D)，19无 (B2S))。从使用贝叶斯 β-二项共轭分析产生的后验概率分布中估计具有95% 可信区间 (CrI) 的客观反应 (OR) 和持久临床获益 (DCB) 率。在B2D中，2名符合方案的患者获得OR (估计真OR率 (95% CrI) 9.8% (2.4-24.3)。真实DCB率估计 (95% CrI): B2D 24.4% (11.1-42.3)，B2S 14.6% (3.6-34.7)。总的来说，在这种情况下不建议使用vistusertib。纵向ctDNA分析表明富集SMARCA4治疗后突变。体外研究显示通过AKT再激活对mTORC1/2抑制的适应性抗性。(NCT02664935，ISRCTN38344105，EudraCT 2014-000814-73，2015年6月10日)
导言大约20-30% 的肺腺癌有STK11突变或缺失
1,
2,
3然而，目前还没有针对这一亚型肺癌的靶向治疗方法。STK11在能量应激条件下激活AMPK，进而激活TSC1/2
4。TSC1/TSC2抑制mtorc1的关键激活剂Rheb。AMPK还以STK11-dependent的方式直接抑制Raptor (一种主要的mTORC1成分)
5。因此，具有STK11缺失或失活的肺腺癌具有低AMPK活化和高mTOR活性。
1。mTORC1信号传导的增加导致下游靶标的翻译增加: 由于S6K的激活和4EBP1的磷酸化抑制，上调促进细胞生长和存活的基因，包括HIF-1α
4,
6,
7。HIF-1α 驱动GLUT1上调，增加葡萄糖代谢，这些增加是可逆的mTORC1抑制剂雷帕霉素
7。因此，mTOR信号可能代表了一种可靶向的治疗脆弱性。
STK11-突变型非小细胞肺癌。
大约8% 的肺腺癌伴有STK11缺失和KRAS突变
8,
9,这使得预后特别差
10,
11,
12。KRAS和STK11的改变协同驱动表观遗传和代谢重编程的程度比单独突变更大，这种现象可通过mTORC1/2抑制而逆转
13,
14。STK11/KRAS共突变的肺癌细胞表现出增加的糖酵解，并且比KRAS单突变或STK11单突变细胞对糖酵解抑制或葡萄糖剥夺更敏感
15。A549 (STK11缺陷型/KRAS突变型肺腺癌) 细胞在常氧条件下再次表现出糖酵解增加和HIF1α 表达增加，两者均随STK11再表达或雷帕霉素治疗而降低
16。在体内，STK11在STK11-deficient/
KRAS突变肺癌模型显著降低肿瘤负荷，消除与肿瘤进展相一致的葡萄糖亲和力增加，并下调糖酵解相关基因和与mTOR信号相关的基因，与其在这种情况下抑制mTOR的作用一致
17。因此，我们假设癌症具有双重
KRAS突变/
STK11失活可能特别容易针对mTOR信号传导。
双重抑制mTORC1/2可能比单独抑制mTORC1更有效。mTORC2是驱动癌细胞系 (包括A549) 糖酵解增强的中心节点
18。Rictor敲除以独立于Raptor，HIF1α 和Akt的方式抑制c-myc介导的糖酵解基因表达和葡萄糖摄取。Rictor的Kockout，A549细胞中mTORC2复合物的关键成分，将葡萄糖摄取降低到类似于Raptor敲除的程度
19。总体而言，mTORC2抑制似乎在有效关闭有氧糖酵解中很重要。此外，单独抑制mTORC1会增强mTORC2的激活，从而允许通过旁路信号传导进行潜在的逃逸。
20。
MLN0128，临床开发为sapanasertib，是一种ATP竞争性双重mTORC1/2抑制剂。MLN0128在A549细胞中比雷帕霉素更有效地抑制pS6K，并且还抑制4EBP1磷酸化以及mTORC2，这两者都不受雷帕霉素的影响
21。与增加AMP/ATP比率的苯乙双胍一样，它是能量应激的有效诱导剂。MLN0128在体外显著且持久地抑制双STK11/KRAS突变细胞中的HIF1α 和GLUT1，并显著降低其葡萄糖消耗和乳酸产生
21。基因工程小鼠模型是理想的系统，其中在具有免疫能力的环境中在体内重述癌症的复杂异质器官特异性生物学。Shackleford小组使用条件激活的k-ras癌基因启动的NSCLC模型对MLN0128进行了体内治疗研究 (LKB1-proficient K吕克小鼠)，并与也带有LKB1 floxed等位基因的小鼠中的LKB1缺失相结合 (KL吕克小鼠)，其中通过鼻内给药腺病毒诱导肺癌
21。在肺肿瘤裂解物中，MLN0128单一疗法引起HIF1α 和GLUT1的强烈抑制，转化为肺肿瘤FDG亲和力的显着且持续的降低和肿瘤生长的抑制。在LKB1精通K中，MLN0128的FDG亲和力和肿瘤生长抑制作用最小吕克肿瘤。到8周时，会出现FDG狂热的耐药性肺癌结节，但这些耐药性结节不是腺癌 (人类STK11-deficient/KRAS突变型肺癌的经典组织学亚型)，而是鳞状细胞癌。这些原理和机制研究的证据表明，在相关的肺癌模型中，KRAS突变体/STK11缺陷型肺腺癌对双重mTORC1/2抑制具有显着的敏感性。
Vistusertib (AZD2014) 与sapanasertib一样，是mTOR激酶的选择性ATP竞争性抑制剂
22。我们报告了在国家肺基质试验 (NLMT) 的治疗组B中使用vistusertib治疗的患者的最终结果，NSCLC的大型分层医学试验，关注NSCLC伴有或不伴有STK11丢失的患者队列
KRAS突变。这是第一项研究mTOR抑制对靶向NSCLC STK11-deficient影响的研究。据我们所知，这是该肺癌亚型靶向治疗的首次前瞻性精确肿瘤学试验。
结果临床试验结果2015年5月13日至2020年1月2日期间，54名患者从13家英国医院登记到NLMT的治疗部门B，在晚期NSCLC中进行的伞状II期平台试验，研究了23种不同的可行生物标志物队列中的9种实验性靶向药物干预措施 (补充图。
1)。5名患者有一个
TSC1或
TSC2突变并被分配到队列b1。49名患者有一个
STK11/
LKB1突变或纯合缺失，并被分配到队列B2: 30伴有
KRAS突变，并被分配到队列B2D; 19人
KRAS野生型 (wt)，并被亚分配给B2S (图。
1)。所有54例患者均纳入vistusertib的安全性分析。6名患者被排除在
按协议导致5、26和17名患者的人群分别包括在B1、B2D和B2S中。由于缺乏疗效，B2S的招募被提前关闭，而B1和B2D的招募又被关闭，再次是由于缺乏疗效和vistusertib在进一步临床测试中的优先级降低。
国家肺矩阵试验B组的患者流程图。
在54名登记的患者中，中位年龄为66岁，59% 为女性。85% 的癌症是腺癌。67% 的患者患有IV期疾病。20% 患者为PS0，70% 为ps1。基线特征的分布在3个队列中相似 (补充表
1)。有52例患者的既往治疗数据。患者接受了1至5行先前的全身治疗 (中位数为2)。在这52例患者中，先前接受的治疗包括铂类双重化疗 (± 免疫治疗/靶向治疗) 占88%，免疫治疗占25%，靶向治疗占27%，放疗占48%，手术占25%。
在数据锁定时 (2023年10月13日)，在每个方案 (分析) 人群中只有2名患者的总生存时间被截尾，随访时光为322天和56天。
在48例符合方案的患者中，接受周期数的中位数为2个周期，患者接受1至17个周期的治疗；71% 的患者接受了1至4个周期的治疗 (包括B1中的所有患者)。停止治疗的最常见原因是疾病进展 (67%)。具有STK11 +/- KRAS的参与者的游泳者图 (队列B2) 显示在图ilb中。
2。有647 ae (不良事件) 和298 ARs (不良反应) 53登记的患者，但只有10% 的这些事件被报告为3级或以上。胃肠道疾病和疲劳是最常见的 (补充表
2)，与之前发布的vistusertib的AE配置文件保持一致。
根据RECIST v1.1，CT评估通过完全或部分反应、稳定疾病、进行性疾病或不可评估来指示和编码。还指出了治疗停止后的随访时间，开始试验后的治疗以及死亡。黑色竖线表示3个月，红色实线表示22周，是参与者可被视为达到持久临床获益阈值的最短时间。
就共同主要结局指标而言，B2D队列中只有2名符合方案的患者或治疗组B中的患者 (2/26) 在该队列中估计真实OR率 (95% CrI) 为9.8% (2.4-24.3) (图。
3A和
4；补充表格
3)，具有非常低的临床相关真或率的概率 (贝叶斯后验概率 (PP) < 0.01)。持久临床获益 (DCB) 定义为24周时的无进展生存期，即第四次治疗中CT评估反应的时间。DCB的结果更令人鼓舞，B2D中的6/26和B2S中的2/17分别估计为24.4% (11.1-42.3) 和14.6% (3.6-34.7) (图
2和
3B；补充表格
3)，但即使在B2D中，临床相关的真实DCB率的可能性仍然很低 (pp = 0.26)。
指示中位数和95% 可信区间的森林地块 (A) 客观反应率，(B) 持久临床受益率，(C) 中位无进展生存时间，以及 (D) 中位总生存时间。OR和DCB的共同主要结局的垂直红线表示将产生GO决策的真实率的最小临床相关阈值。(的kaplan-meier曲线E) 无进展生存时间，以及 (F) 总生存时间。
图4: 指示B2群组中患者的靶病变直径总和的最佳百分比变化的瀑布图。
在没有返回测量结果的情况下停产的符合方案的参与者包括在图的左侧，默认测量结果为 + 100%。
就目标病变直径总和的最佳百分比变化而言，瀑布图显示B2D和B2S之间没有明显的隔离，两种类型的患者分布在整个值范围内 (图
4)。所有队列的中位PFS估计小于3个月 (图。
3C, E；补充表格
3)。B2S的总生存时间最好，中位数为9.8个月 (6.2-16.9)，B2D的中位数为6.1个月 (4.2-9.3) (图。
3D, F；补充表格
3)。
在8例STK11-deficient DCB患者中，目标病变总和的中位最佳百分比变化为-18.5%，范围为-48% 至3%。在同一队列中，在18名记录的PFS时间小于3个月的患者中，可评估该结果，中位百分比变化为 + 10.5%，范围从 − 6% 到 + 48% (图。
4)。
我们使用Illumina TSO500平台分析了纵向ctDNA图谱。使用常规的
p < 0.05就显著性而言，2个基因在治疗后与基线样本中显著富集: 排名靠前的是SMARCA4 (基线时可在3名患者中检测到 (8.3%，3/36) 在11例治疗后可检测到 (40.7%，11/27，
p = 0.004)，其次是FOXP1 (基线0例患者与治疗后4例患者 (15%，4/27)，
p = 0.029)。我们表明，与FOXP1不同，SMARCA4突变在STK11突变体LUAD中被阳性选择，并且在50% 的原始样本中是亚克隆的 (补充图。
2)。所有确定的SMARCA4突变均为致病性 (移码，三核苷酸indel，致病性剪接或CADD > 20
23、补充表
4)。我们想知道SMARCA4缺陷克隆是否由于mTOR激活水平较低而固有地对mTOR抑制不太敏感。补充图。
3确实表明，携带SMARCA4驱动突变的LUAD具有显著较低的mTOR激活和mTORC2底物aktser473的激活。
在进行这项研究期间，由于在肾癌和乳腺癌的随机试验中与依维莫司相比结局较差，vistusertib的临床开发于2018年末终止。
24,
25。鉴于此，我们比较了有和没有STK11-deficient NSCLC细胞系的敏感性
KRAS体外vistusertib和依维莫司治疗的突变。用vistusertib处理的所有6种细胞系均显示出剂量依赖性的活力降低，在药理相关剂量下所有细胞系均达到IC50 (图
5)。相比之下，任何含有野生型的STK11-deficient细胞都没有达到IC50。
KRAS当用依维莫司治疗时。而在伴随突变的STK11-deficient细胞系中达到IC50
KRAS,这是在依维莫司浓度高于药理学可达到的浓度的数量级。
A-D用0-10 µ m vistusertib或依维莫司处理48小时后，NCI-H460，A-427，NCI-A549 (STK11mut KRASmut) 和ChaGoK1，NCI-H1755，CAL-12T (STK11mut KRASwt) 的细胞活力，表示为来自至少3个独立实验的平均值 ± SEM。药理学相关浓度以阴影区域表示，根据以前的出版物计算
63,
64。E用1µM依维莫司与1µM vistusertib处理的细胞的相对发光 (数据来自相同的实验，如A-D)。F显示了依维莫司和vistusertib在STK11突变型NSCLC细胞系中的计算的IC50值。
在肾癌研究中，与依维莫司相比，假定结果较差的一个重要原因是通过mTORC2抑制引起的初始AKT抑制缓解了受体酪氨酸激酶信号的反馈抑制，导致AKT的后续激活和包括促凋亡FOXO转录因子在内的靶标的抑制性下游磷酸化
26,
27。给定的STK11是由Akt磷酸化FOXO所必需的
28,我们最初假设这种适应性抵抗机制可能在STK11-deficient LUAD中不太相关。然而，鉴于FOXO的抑制可能是使用vistusertib治疗肾癌的不良结果的建议
27,我们在基线以及用2 µ m vistusertib治疗后1和24 °h评估了PI3K/AKT通路信号传导 (图。
6)。MCF7乳腺癌细胞用作阳性对照，因为mTORC1/2对反馈抑制的缓解在该细胞系中得到很好的表征
26。如前所述，我们证明了在mcf7中1 °h完全丧失后24 °h FOXO3a/FOXO1的明显反弹磷酸化。在所有STK11-deficient细胞系中，我们证明虽然Ser473处的Akt磷酸化在1 °h降低，但它在24 °h重新激活，尽管未达到基线水平。基线FOXO1/3a磷酸化在所有STK11-deficient细胞系中较低，水平在1 °h进一步降低，但在24 °h有明显的反弹磷酸化，达到超过基线水平。全部
STK11突变细胞系在用vistusertib处理后显示出Erk磷酸化增加，最明显的是在1 °h。因此，
STK11突变NSCLC细胞系不能免除响应于mTORC1/2阻断的受体酪氨酸激酶信号传导的反馈抑制的缓解。
MCF7 (对照乳腺癌细胞系)，NCI-A549和NCI-H460 (STK11MUTKRASMUT) (左) 和MCF7，ChaGo-K-1和CAL-12T (STK11MUTKRAS重量) (右) 用2 µ m vistusertib处理。在指定的时间收集裂解物。实验在独立的生物重复上进行三次，显示代表性印迹。
讨论尽管有强有力的临床前理论支持在STK11-deficient肺癌中使用mTORC1/2抑制，但vistusertib的临床活性显然令人失望，即使在伴有
KRAS突变。因此，不能推荐vistusertib作为该NSCLC子集的潜在个性化治疗选择。细胞系敏感性数据表明，依维莫司的替代临床测试不太可能改变我们的结论，即mTOR抑制在STK11-deficient肺癌中价值有限。事实上，在依维莫司在TSC1/2失活或mTOR突变激活患者的泛癌症队列中的II期试验中，在当前报告中，应答率和DCB率在数值上低于队列B2D的应答率和DCB率。
29。Sapanisertib (MLN0128) 为在双重STK11丢失和
KRAS突变
21。然而，与vistusertib一样，sapanisertib在肾癌和ER乳腺癌中也未能改善依维莫司的预后
30,
31。在前一项研究中，与依维莫司相比，沙巴司的中位OS减少了6个月，缓解率分别为0% 和16.7%，沙巴司导致停药的治疗相关不良事件的发生率增加了三倍
30。最后，虽然STK11似乎是AKT下游信号传导抑制促凋亡分子所必需的
27,我们显示尽管STK11缺乏，但FOXO3a/FOXO1在24 °h仍被重新磷酸化。这种适应性抵抗可能是限制mTORC1/2抑制在STK11-deficient LUAD中的影响的一个原因，如先前在其他情况下所建议的
27。事实上，AKT的激活被假定为驱动鳞状癌的抗性，最终在KL进展。吕克mTORC1/2双重抑制下的小鼠
21。
这项研究的一个重要的初始前提是，STK11丢失的代谢后遗症，特别是与
KRAS突变，将产生可使用mTORC1/2抑制利用的增强的糖酵解的代谢脆弱性。如上所述，相关小鼠模型中的数据
KRAS突变体/STK11缺陷型腺癌完全支持这一假设
21。然而，随后的数据表明，糖酵解抑制
KRAS与鳞状肺癌中糖酵解的抑制相比，突变/STK11缺陷基因型构成相对较弱的脆弱性。与其他LUAD细胞系相比，A549细胞的GLUT1表达略高，但水平远低于鳞状细胞肺癌 (LUSC) 细胞系。
32。A549
STK11/
KRAS共突变的肺腺癌细胞比其他LUAD细胞系对GLUT1敲低更敏感，但是它们继续增殖。相反，GLUT1敲低显着抑制LUSC细胞的生长并诱导凋亡。此外，GLUT1敲低显著降低体内LUSC生长，但对A549异种移植物没有影响。乍一看，这些后来的研究表明，vistusertib在STK11缺陷/
KRAS突变肺癌可能已经被预测。然而，HIF1α 和GLUT1的下调并不是mTORC1/2抑制的唯一影响: 而MLN0128单一疗法对KL的肿瘤生长具有显着影响吕克模型，雷帕霉素不能影响肿瘤生长
21。这两种药物作用的关键差异是MLN0128抑制4E-BP1磷酸化，不受雷帕霉素影响。虽然使用结合eIF4E的显性阴性4E-BP1突变体来抑制帽依赖性翻译会导致STK11-deficient/
KRAS突变细胞对糖酵解没有影响
21。事实上，该小组早些时候已经表明，由糖酵解抑制剂2DG驱动的代谢应激在A549细胞中诱导最小的凋亡，这与苯乙双胍引起的能量应激不同
33。这表明MLN0128在KL中的体内功效吕克模型仅部分与糖酵解抑制有关。4E-BP1磷酸化的抑制，我们也显示在这里使用vistusertib在STK11缺乏症的设置将减少多种其他关键分子的表达，除了HIF-1α/GLUT1促进癌细胞增殖，生长，通过抑制其上限依赖性翻译而存活
34。
mTOR抑制作为STK11-deficient LUAD的治疗策略强调STK11-dependent AMPK激活的作用。然而，AMPK损失并不表型STK11损失
KRAS突变NSCLC小鼠模型
35。虽然STK11的敲除如预期的那样大大加速了增长，但AMPK敲除阻碍了增长。在葡萄糖耗尽下，AMPK敲除
KRAS突变型TP53条件性缺失 (KP) 细胞比亲本AMPK野生型KP细胞增殖更慢。AMPK的促肿瘤发生作用似乎是由于响应葡萄糖消耗而促进溶酶体基因表达。Tfe3是该程序的主要转录激活因子，在高营养条件下通过mTOR强制磷酸化保留在细胞质中。在葡萄糖剥夺后，AMPK被激活，抑制mTOR并去抑制tfe3。最后，STK11-downstream靶标SIK1和SIK3介导了STK11的大部分抗肿瘤作用，因此可以探索靶向驱动IL-6产生的CREB依赖性转录的慢性上调的疗法。
36。
SMARCA4是在进展中观察到的最显著富集的共突变。值得注意的是，STK11和/或
KRAS基线和进展时的突变非常相似，进展时只有一个损失和一个收益。在
SMARCA4突变肺癌，
STK11共突变存在于39% 和
KRAS36% 的病例共突变: 这两种突变中的任何一种的存在都会导致预后明显恶化，所有3种基因共突变的累加效应
37。我们已经表明
SMARCA4突变通常是亚克隆的，鉴于进展的频率为41%，vistusertib可能导致
SMARCA4突变亚克隆，因此可以在液体活检中以与基线预处理大致相同的方式检测到
EGFR在用第一/第二代egfrtki处理后选择T790M亚克隆。我们的数据增加了现有的文献，这些文献描述了靶向治疗获得性耐药时SMARCA4丧失的出现
38但也是一个重要的共突变在基线驱动原发性电阻，包括抑制
KRASG12C
39,
40和EGFR突变肺癌与奥希替尼
41。
值得注意的是，人肺癌中SMARCA4的缺失与NRF2靶标表达的增强有关; 这种作用可以在体外得到体现，其中SMARCA4敲低使KEAP1失活，激活NRF2并增强血红素加氧酶1的表达。
42。在EGFR突变细胞中，osimertinb激活ROS，从而驱动线粒体分裂和凋亡
43,
44。响应于增强的ROS，NRF2途径被缓冲ROS的血红素加氧酶1的上调激活。该途径的抑制重新建立了高ROS水平，导致细胞死亡增强。如前所述，电阻发生在KL吕克通过腺鳞状转变 (AST) 的模型
21。在mTORC1/2抑制的进化压力下，这不是该GEMM的特殊性。治疗前KcL模型 (其中G12C是有条件突变的，并且是LKB1-deficient的) 一致地显示腺癌组织学: 通过鳞状分化再次抑制G12C后产生耐药性，尽管保持了RAS信号的抑制
45。重要的是，一部分缺乏STK11的人LUAD表达鳞状细胞癌特征 (SCC) 与TTF1对应物相比，这些p63损伤表达较高水平的抗氧化转录因子NRF2和较低水平的ROS诱导的DNA氧化损伤
46。KL模型中ROS的减轻显著降低了AST。在STK11缺陷型G12C突变病例中，基线SCC特征驱动adagrasib对G12C抑制的临床抗性
45。因此，我们在这里在ctDNA分析中证明的SMARCA4突变的富集是完全可行的，它代表了在双重STK11缺乏症和KRAS的背景下缓冲靶向治疗产生的高毒性水平的ROS的另一种手段。突变。最后，我们证明SMARCA4熟练的肺腺癌具有更高的AKT和mTOR激活。因此，这可能会使
SMARCA4突变克隆固有地对mTOR的抑制不敏感
SMARCA4野生型对应物。
FOXP1突变在进展中也显著富集。FOXP1缺失促进A549细胞增殖和迁移
47也会影响mTOR信号
48,
49。
NLMT试验利用贝叶斯适应性试验设计来筛选靶向治疗疗效。公认的是，此处报告的手臂的患者数量相对较低，反映出由于缺乏疗效而导致手臂过早闭合。同样重要的是要注意，人口经过大量预处理，并且主要是英国白人，这可能会限制全球人口的普遍性。尽管存在这些局限性，但基于目前的分析，我们无法推荐将mTORC1/2抑制试验扩大到更大的STK11-deficient NSCLC人群。至关重要的是，这项工作还强调了个性化医疗时代适应性和新颖试验设计的价值。
总之，vistusertib在STK11-deficient非小细胞肺癌中的适度影响部分是由于选择了SMARCA4共突变克隆与FOXO失活驱动的适应性抗性一起处理。肺腺癌中STK11缺乏的相关代谢重组似乎代表了有限的治疗脆弱性。此外，STK11-deficient NSCLC的致癌性机制似乎不是主要通过AMPK激活的丧失。鉴于有明确的证据表明，糖酵解的抑制似乎是LUSC中真正的代谢和治疗脆弱性，我们很快就开始招募到keto-lung试验中，该试验将生酮饮食与LUSC中的化学免疫疗法相结合。
方法试验设计和患者选择患者被招募到NLMT的治疗组B (临床试验。Gov NCT02664935，ISRCTN38344105，EudraCT 2014-000814-73)，采用先前发表的完整方法
50,以及补充提供的试验方案。该试验于2015年6月10日提交并发布给ISRCTN。由于笔误，这是在试验开始并于2015年5月13日登记了第一位患者之后。重要的是，在这个时候，这符合卫生研究管理局的时间表，从开放开始最多6周 (
https://www.hra.nhs.uk /规划和改进-研究/研究-规划/研究-注册-研究-项目-标识符/)。423名患者中只有1名患者在试验登记前登记，第二名患者于2015年6月16日招募。总而言之，这是一项在晚期NSCLC中进行的伞形II期平台试验，研究了23个不同的可行生物标志物队列中的9种实验性靶向药物干预措施 (补充图。
1)。
如前所述，患者通过分层医学计划2进行筛查，这是一项针对晚期肺癌的观察性预筛查研究
49,
50。所有患者都签署了试验和基因组分析的知情同意书。分析使用了自定义SMP2v。01或SMPV2v。02组28个基因，通过定制的Nextera快速捕获测序测定 (Illumina) 鉴定遗传变异，并从50 ng DNA (用于肿瘤的FFPE，用于种系检测的血液) 生成文库并在Illumina MiSeq系统上进行测序。使用isSAAC (Illumina) 将测序读数与hg19比对，使用Strelka对单核苷酸变体进行变体调用
51、SCNAs的CRAFT (Illumina) 和结构变体的Mantra
52。畸变被分类为1级、2级或3级，其中1级和2级表示NLMT内队列的畸变授予资格。
NLMT的治疗组B在3个独立的队列中研究了vistusertib的治疗; 符合条件的TSC1或TSC2突变患者被分配到队列B1，以及那些具有STK11/LKB1突变或纯合缺失的队列B2，如果存在伴随的KRAS突变，则将其分配给队列B2D (双重) 或队列B2S(单) 如果不是; 每个队列的目标招募是30名患者。在本出版物发布时
50这是整个试验的概述，这里报道的最大的队列，B2D和双重mTORC1/2抑制最有说服力的理由的队列，仍然对招聘持开放态度，最终达到了招聘目标。较早的概述论文也不包括此处提供的翻译数据。
符合条件的患者具有组织学或细胞学确诊的NSCLC III期 (不适合根治性放疗或手术) 或根据实体瘤疗效评估标准可测量疾病的IV期 (RECISTv.1.1)，并且需要以前接受过抗癌治疗或拒绝接受标准护理一线治疗; 完整的资格标准可以在Middleton等人的补充材料中的试验方案中找到。
50。所有患者均根据《良好临床实践》和《赫尔辛基医学研究伦理原则宣言》签署了知情同意书。NLMT符合所有监管要求; 获得了中南部牛津大学研究伦理委员会的伦理批准; 临床试验授权由英国药品和保健产品监管局授予。该试验由伯明翰大学赞助，由英国癌症研究临床试验部门运营。
Vistusertib (AZD2014) 每天口服两次，间歇给药，剂量为125 °mg bd 2天，停药5天，持续28天，直至疾病进展；如果患者耐受并且有临床益处，则可以在进展后继续进行试验治疗。在给药前在第一个治疗周期之前收集用于ctDNA的血液，然后每8周 (每隔一个周期) 收集一次。
统计设计与分析使用贝叶斯适应性试验设计来筛选NLMT中的每个实验靶向药物干预，以获得每个选定的分子定义的队列中的功效信号。对于治疗组B，所有3个队列的共同主要结局指标为客观反应 (OR)，其定义为根据RECIST v.1.1确认的完全或部分反应的发生率。
53DCB定义为在开始治疗后约24周时，在第四方案定义的CT评估中保持无疾病进展的发生率。次要结局包括无进展生存时间 (PFS)，进展时间 (TTP)，目标病变直径总和的最佳百分比变化，总生存时间 (OS) 和不良事件 (AE)。
OR和DCB率均由后验概率分布估计，后验概率分布使用贝叶斯 β-二项共轭分析生成，beta (1，1) 先验信息最少，报告的可信区间为95%
54。PFS，TTP和OS的中位时间是根据使用贝叶斯指数逆伽马 (IG) 共轭分析和最低信息IG(0.001，0.001) 生成的后验概率分布估算的。之前和报告的95% 可信区间
55。使用瀑布图直观地报告靶病变直径总和的最佳百分比变化。决策准则、样本量和操作特征在Middleton等人中进行了描述。
50。
Ae被定义为任何不良医疗事件，不一定与治疗有因果关系。不良反应 (ARs) 定义为与任何剂量的研究药物相关的不良和意外反应 (报告研究者判断为具有因果关系)。
循环肿瘤DNA提取和文库制备为了本分析的目的，如果有的话，在基线和进展或治疗中断时提取DNA (补充图。
4)。如果没有可用的中止样品，则提取最后可用的样品。使用QIAamp循环核酸试剂盒 (QIAGEN，55114) 从至多5ml血浆中提取cfDNA。使用Agilent 22000 tapestation，使用Agilent高灵敏度D5000 ScreenTape和试剂 (agilenttechnologies，5067-5592和5067-5593) 定量90-270 °bp的分数。使用TruSight Oncology 500 ctDNA试剂盒 (Illumina，20039252) 完成文库制备，cfDNA输入为9-75 ngdna。当定量的DNA <9ng时，输入被判断为不足。将样品24重合并到S4流动池中，并在NovaSeq 6000仪器上测序至35000 × 归一化读取深度覆盖率的中位数。使用适当的DRAGEN管道对truesight肿瘤学处理生成的FASTQ文件500 ctDNA,生成一组最终的BAM、变体VCF、TMB、与hg38基因组比对的MSI和拷贝数变体。使用vcf2maf将VCF文件转换为MAF文件格式
56,合并后导入到
maftools v2.1657通过
R/Bioconductor v.4.20/3.1758用于分析。所有处理均在伯明翰大学熊HPC服务 (
http://www.birmingham.ac.uk/bear)。该队列的原始数据可在NIH SRA上获得 (登录号: SUB13654759)。
NCI-A549 (86012804，RRID:CVCL_0023) 和ChaGo-K-1 (6020948，RRID:CVCL_1121) 获自ECACC。CAL12T (acc443，RRID:CVCL_1105) 获自DSMZ; NCI-H460 (HTB-177，RRID:CVCL_0459) 和NCI-H1755 (CRL-5982，RRID:CVCL_1492) 获自ATCC。MCF7 (RRID: CVCL_0031) 和A-427 (RRID: CVCL_1055) 是乔·莫里斯教授的礼物。在实验完成后，使用STR分型通过ATCC鉴定所有细胞系。细胞在具有L-谷氨酰胺 (sigma-aldrich，Missouri，R8758) 和10% 胎牛血清 (sigma-aldrich，F7524) 和1% 青霉素-链霉素 (Invitrogen，15140122) 的RPMI-1640中生长。使用ez-pcr支原体测试试剂盒 (biologicalindustries，20-700-20) 常规测试所有细胞系的支原体。至少，在实验开始之前和实验完成之后，所有细胞系被确认为支原体阴性。所有实验均在细胞系接收的20代内进行。所有实验一式三份进行，每个重复在独立传代上进行。
细胞活力将细胞以1000-1500个细胞/孔接种在不透明的96孔板 (Corning，3610) 中。12 °c后，用vistusertib (AZD2014) (SelleckChem，S2783) 或依维莫司 (SelleckChem，S1120) 处理细胞。DMSO浓度在所有条件下标准化，最大DMSO浓度为0.1%。处理48小时后，使用celltiter-glo2.0 (Promega，G9241) 测量细胞活力。结果表示为相对发光，相对于载体对照减去背景发光 (无细胞的培养基)。使用graphpadprism 9 (RRID:SCR_002798) 用非线性回归绘制最佳拟合曲线。绝对IC50定义为导致细胞活力降低50% 的药物浓度，其值通过Prism计算。
抗体所有一级抗体购自细胞信号: P-FOXO1 (Thr24)/FOXO3a(Thr32) 1:1000 (#9464，RRID: AB_329842); pAkt(Ser473) 1:1000 (#4060，RRID: AB_2315049)，pErk1/2 (Thr202/Tyr204) 1:1000 (#9101，RRID: AB_331646)，Phospho-S6核糖体蛋白1:1000 (#2211，RRID: AB_331679)，p-4EBP1(Thr37/46) 1:1000 #9459，RRID:AB_330985)，B-肌动蛋白1:1000 (4970，RRID: AB_2223172)。
蛋白质印迹法将细胞接种在6孔板中，第二天加入vistusertib并在指定时间收集裂解物。根据标准技术，使用RIPA缓冲液 (thermofisherscientific，89901) 与蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 (细胞信号传导技术，5872) 制备裂解物。使用Pierce牛血清白蛋白 (BSA) 蛋白质测定试剂盒 (Thermofisher，23227) 定量蛋白质。使用Pierce泳道标记物还原样品缓冲液 (Thermofisher，39000) 在还原条件下制备样品，并在12% mini-proteantgx预制凝胶 (bio-rad，4561043) 上运行。Precision Plus WesternC标准确认分子量 (bio-rad，1610376)。在90 °v下在PVDF膜 (gehealthcare，德国) 上进行90 °c的湿转移。将膜封闭 (在室温下1 °h，在1 °x °tris缓冲盐水，0.1% Tween 20 (TBST) 中5% 干燥的脱脂奶粉 (Marvel))，并与第一抗体 (在5% BSA/TBST中稀释) 在4 °c孵育过夜。将膜在TBST中洗涤三次，与第二抗体在室温下孵育1 °c，并再洗涤三次。对于pFOXO1和pAkt，使用SuperSignal West Femto最大灵敏度底物 (Thermofisher，34095) 进行化学发光，对于所有其他靶标，使用SuperSignal West Pico Plus (Thermofisher，34580) 进行化学发光。使用独立收集的和给药的样品将所有印迹重复三次。使用fusionfx6xt数字成像系统 (Vilber) 对印迹进行成像 (补充图中提供的所有印迹的原始图像。
5和
6)。
C-Bioportal (RRID:SCR_014555)
59,
60用于探索TCGA pancer Atlas肺腺癌队列中SMARCA4改变状态与MTOR和Akt磷酸化之间的关联
61,使用RPPA数据进行Akt Ser473磷酸化分析仅限于具有两个谱的数据的样品。
TRACERx研究中肺腺癌的多区域全外显子组测序用于确定SMARCA4克隆和亚克隆非同义突变率，FOXP1和TRAF2在如Frankell等人所述的STK11突变体或STK11野生型背景中。
62。
数据可用性对于NLMT数据，将考虑来自具有适当资格的研究小组的科学合理的建议以进行数据共享。应通过向
newbusiness@trials.bham.ac.uk返回完整的数据共享申请表和主要申请人和统计师的简历来提出请求。数据共享申请表可获取有关研究的特定要求，统计分析计划和预期发布时间表的信息。该请求将由伯明翰大学英国癌症研究临床试验部门 (CRCTU) 主任与首席研究员，相关试验管理小组和独立试验指导委员会进行讨论。在做出决定时，主任委员会将考虑请求的科学有效性，研究小组的资格，首席研究者，试验管理小组和试验指导委员会的意见，同意安排，匿名请求数据的实用性和合同义务。如果CRCTU主任和适当的审判委员会支持该请求，并且尚未获得，在通知申请人其请求结果之前，将征求试验发起人的数据传输同意。预计申请人将在收到原始请求后3个月内收到决定通知。此处公布的结果部分基于NCI和国家人类基因组研究所建立的TCGA试点项目产生的数据。通过基因型和表型数据库 (dbGaP) 授权 (登录号: phs000178.V10.p8) 检索数据。本研究中使用的TRACERx测序数据集描述于Frankell等人。
62。
提升卡
置顶卡
沉默卡
喧嚣卡
变色卡
千斤顶
显身卡
